体外转录mRNA系统的建立及其在呼吸道合胞病毒疫苗中的应用

Development of in vitro transcribed mRNA and its application in respiratory syncytial virus vaccine

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摘要目的建立mRNA的体外转录系统,并用于评价呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)mRNA疫苗的免疫效果.方法以增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为模式蛋白,将EGFP 基因分别克隆入pcDNA3.1(+)和pmRV载体中,通过体外转录合成EGFP mRNA,以验证载体及mRNA框架结构的正确性;然后将RSV融合前F蛋白(RSV preF)序列构建于经验证的载体,体外转录合成RSV preF mRNA;转染细胞后,通过荧光显微镜、流式细胞术、免疫荧光和Western blot等方法验证蛋白表达;进一步通过微流控技术用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)包封体外转录合成的mRNA,经过粒径和多分散性指数检测后进行小鼠免疫和评价.结果经过验证发现,pcDNA3.1(+)的框架结构更适合mRNA;EGFP mRNA转染HEK 293T细胞24h后,体外转染效率>90%;免疫荧光和Western blot等方法验证RSV mRNA能够在24h内表达preF;包封后的RSV mRNA疫苗免疫小鼠,血清抗体滴度与RSV preF蛋白免疫抗体滴度相近(P>0.05),细胞因子IFN-γ和IL-4均有一定程度的上调.结论建立了正确表达目的蛋白的mRNA体外转录系统,以此为基础的RSV mRNA疫苗在小鼠体内可诱导强的免疫应答,为潜在的RSV mRNA候选疫苗奠定了基础.