换一批
换一批大肠杆菌外膜蛋白酶T及其突变体的表达、复性及生物活性分析
Expression, refolding and characterization of Escherichia coli outer membrane T and its mutant
摘要外膜蛋白酶T (Outer-membrane protease T,OrnpT)是定位于大肠杆菌外膜,具有高度底物特异性的蛋白水解酶.本文旨在建立克隆表达膜蛋白OmpT和体外复性的方法,考察其蛋白酶活性.首先以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增ompT基因,连接至pET28a (pET-ompT),引入点突变Asp85Ala,构建表达质粒pET-ompT85.然后将两种重组质粒转化入BL21 (DE3),均以包涵体形式大量表达.纯化后的蛋白经稀释法复性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢复蛋白酶活性.通过SDS-PAGE,鱼精蛋白水解试验及生长曲线观察表明,重组蛋白OmpT在体外能水解抗菌肽鱼精蛋白和兔肌肉肌酸激酶,而OmpT突变体则无上述功能.上述结果表明本文获得了具有蛋白水解酶功能的重组蛋白OmpT,该蛋白在体外可保护大肠杆菌抵抗鱼精蛋白的杀菌作用.
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