基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造

Enhancing enzyme activity and thermostability of cephalosporin C acylase based on B factor analysis

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摘要[目的]筛选Pseudomonas sp.SE83 acyⅡ定点饱和突变库,获得动力学稳定性提高的头孢菌素C (CPC)酰化酶突变体,并对突变酶进行初步的结构-功能关系分析.[方法]靶标酶Pseudomonas sp.SE83 acyⅡ与Pseudomonas diminuta N176具有较高的同源性,通过分析N176的结构B因子,构建CPC酰化酶SE83定点饱和突变库;基于pH指示剂显色法,采用BiomekFXP自动工作站建立CPC酰化酶高通量筛选方法,获得优良突变酶,对其活性、稳定性等酶学性质进行表征;利用SWISS-MODEL对突变体进行同源建模,探讨突变体结构与功能的关系.[结果]通过B因子分析和同源结构比对,共找出9个靶标位点;经过3轮筛选,发现R218及K226位点突变显著提高酶的热稳定性,其中最显著的R218Q和K226V在40℃的半衰期分别为野生型的3.77和2.77倍,催化效率Kcat/Km分别为野生型的1.8和3.1倍.同源建模分析表明氢键作用和疏水相互作用的增加可能是突变体稳定性提高的原因.[结论]B因子指导的酶分子改造是一种高效可靠的动力学稳定性改造策略,突变体R218Q和K226V均可提高CPC酰化酶的稳定性和催化效率,对进一步的CPC酰化酶分子改造具有一定的参考价值和指导意义.

作者刘新花 ^[1] 杨广宇 ^[2] 邓子新 ^[3] 谢渊 ^[2] 刘天罡 ^[3] 学术成果认领

作者单位武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室湖北武汉430071 ^[1] 武汉瀚海新酶生物科技有限公司湖北武汉430075 ^[2] 武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室湖北武汉430071;湖北省合成微生物技术工程实验室武汉生物技术研究院湖北武汉430075 ^[3]

关键词头孢菌素C酰化酶半衰期动力学稳定性 B因子 Biomek FXP高通量筛选 CPC acylase Half-life Kinetic stability B factor Biomek FXP high throughput screening

主题词性(Sex)动力学(Kinetics)突变(Mutation)高通量筛选分析(High-Throughput Screening Assays)半衰期(Half-Life)

栏目名称 微生物工程与药物研究

DOI 10.13344/j.microbiol.china.160731

发布时间 2017-07-26

基金项目

National Natural Science Foundation of China (No.31670090)国家自然科学基金项目