利用Red重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因

Knockout of hcp genes in Salmonella typhimurium by Red recombination system

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摘要[背景]沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,可引起广泛的胃肠炎以及伤寒、副伤寒,其致病机制一直未被阐明.基因敲除技术在研究沙门氏菌致病性方面发挥了重要作用,然而目前的敲除技术仍存在费时、成功率低的问题.研究发现鼠伤寒沙门氏菌含有Ⅵ型分泌系统,其组成成分之一溶血素共调节蛋白 (Hemolysin-coregulated protein,Hcp) 可能在其致病过程中发挥了重要作用.[目的]拟通过对3个编码Hcp蛋白的基因进行敲除,在鼠伤寒沙门氏菌中建立一套方便快捷的重组系统,从而用于沙门氏菌致病性的研究.[方法]以pKD4为模板,扩增两端带有目的基因同源序列的卡那霉素抗性基因片段,将片段导入含重组酶系统的目的菌,重组后再导入质粒pCP20消除抗性基因片段,达到无痕敲除的效果.[结果]对3个单独的hcp基因及其组合进行了敲除,得到了所需的基因缺失株,并总结出了一些实验过程中可能遇到的问题的解决方案.[结论]Red重组系统可用于鼠伤寒沙门菌的基因敲除,通过优化同源片段的长度、PCR模板浓度、L-阿拉伯糖加入时间、实验过程中的温度等实验条件,提高Red重组系统在沙门氏菌中的重组效率.此方法简单、快速,重组效率高,值得推广.