摘要[背景]阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A(coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成“a”系列或“b”系列的阿维菌素.[目的]探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造.[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体.以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性.[结果]AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min-1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min-1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min).选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M.按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q 149L/L 121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min-1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min).[结论]研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据.