摘要[背景]猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是严重影响养猪业健康发展的动物传染病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV).PEDV结构蛋白之一——棘突蛋白(spike protein,S protein)负责病毒的侵染、入胞等过程,该蛋白结构和功能研究是PEDV分子生物学研究的热点.S蛋白分为两个功能域,N端的S1 亚单位和C端的S2亚单位,以往研究表明PEDV DR13att毒株S1N(19-233 aa)结构域缺失,不影响DR13att毒株的存活和增殖.[目的]基于靶向 RNA 重组技术,在 PEDV(DR13att)S1N结构域分别引入 HA 标签基因、抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)基因,构建重组PEDV,考察S1N结构域能否被标签(记)蛋白或多肽替换.[方法]利用靶向RNA重组技术的PEDV反向遗传学操作平台,将转移载体p-PEDV-DR13att的S1N结构域(1-234 aa)分别替换成HA基因、APEX2 基因,进行重组转移载体的构建,再分别将线性化的载体体外转录的RNA转染至 mPEDV 感染的 LR7 细胞,然后在 Vero 细胞上拯救重组 PEDV.通过观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)、Western blotting检测对重组病毒进行验证,最后测定重组病毒滴度并绘制重组病毒生长曲线,探究重组病毒与亲本病毒的生长特性.[结果]构建的重组病毒经过拯救和传代,发现引入HA标签蛋白的重组猪流行性腹泻病毒rPEDV-DR13-S1N-HA(rPEDV-DSH)在P1代出现细胞病变,引入APEX2 蛋白的重组猪流行性腹泻病毒rPEDV-DR13-S1N-APEX2(rPEDV-DSA)盲传至P4 代,未出现细胞病变.对P4 代的rPEDV-DSH、rPEDV-DSA进行RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析、蛋白质印迹法验证,证实引入HA标签的重组病毒rPEDV-DSH拯救成功,而携带APEX2 的重组病毒未能拯救成功.重组病毒rPEDV-DSH生长曲线表明rPEDV-DSH与亲本毒株DR13att有相似的生长趋势,但病毒增殖水平显著低于亲本毒株.[结论]HA标签替换S1N(1-234 aa)结构域的重组PEDV rPEDV-DSH成功拯救,为进一步研究S蛋白与宿主细胞的互作机制建立了基础.