希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC1A01703)二十碳五烯酸生物合成基因簇的钓取及鉴定

Isolation and Characterization of the Eicosapentaenoic Acid Biosynthesis Gene Cluster from Shewanella marinintestina MCCC 1A01703

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摘要希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1 A01703)是从海洋动物肠道分离得到的1株产二十碳五烯酸(Ecicosapentaenoic acid,EPA)的海洋细菌.利用PCR方法、Overlap PCR及Gibson Assemble技术克隆该菌中包含加A、pfaB、pfaC和pfaD的EPA生物合成基因簇,全长18.4 kb.序列分析表明所钓取的合成基因簇与来自希瓦氏菌SCRC-2738的EPA合成基因簇有88％的相似度,均编码聚酮合酶.以构建的低拷贝表达载体pACYC-Trc为骨架,通过Gibson Assemble技术构建EPA基因簇表达质粒pLYSCY03.钓取大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)细胞中的entD基因,克隆至表达载体pTrc99a中,构建成为重组质粒pLYSCY01.将两个表达质粒同时导入大肠埃希菌(Escherichia coli DH5c)中,获得产EPA的工程菌株.结果表明,希瓦氏菌中含有EPA聚酮生物合成基因簇,大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中的entD基因可以替代pfaE基因与钓取的EPA合成基因协同合成EPA.