绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

Prokaryotic expression of recombinant PE38KDEL protein and preparation of its polyclonal antibody

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摘要目的：通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素（PE）PE38KDEL重组蛋白，并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法：选择PE部分基因（PE38），并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL，通过原核密码子优化（http：//www.jcat.de）后全基因合成，经Hind III和Xho I酶切位点克隆至pET32a（+）原核表达载体，构建pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒，将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细菌中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组PE38KDEL蛋白，经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白，采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体，并采集免疫前后血清，用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果：成功构建了pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 kDa，与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示，在分子质量约57 kDa处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体，抗体效价高达1：60000。结论：PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体，且该抗体效价高、特异性强，为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。