换一批TGFβR3基因3'UTR双荧光素酶报告载体的构建及其与miR-let-7a靶向关系的验证
Construction of TGFβR3 gene 3'UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between TGFβR3 and miR-let-7a
摘要目的:构建Ⅲ型转化生长因子β受体(TGFβR3)基因3'非编码区(3'UTR)双荧光素酶报告载体,并分析其与miR-let-7a的靶向关系.方法:根据microRNA靶基因预测软件targetscan获取miR-let-7a与TGFβR3基因3'UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出TGFβR3基因3'UTR序列并克隆至pGEM-T载体,定点突变潜在互补结合位点后双酶切pGEM-T载体获取目的片段并插入至双荧光素酶报告载体获得野生型和突变型重组双荧光素酶报告载体,测序鉴定;将2种载体分别与miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同转染HEK293T细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性.结果:经测序鉴定成功构建野生型和突变型重组荧光素酶报告载体.双荧光素酶报告系统检测显示,共转染miR-let-7a mimics和野生型双荧光素酶报告载体的荧光素酶活性比miR-let-7a NC组明显降低(P<0.05),而共转染突变型双荧光素酶报告载体后其荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05).结论:成功构建TGFβR3基因3'UTR双荧光素酶报告载体,并证实TGFβR3基因是新发现的miR-let-7a直接靶向调控基因.
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关键词
mioroRNAsmiR-let-7aIII型转化生长因子β受体双荧光素酶报告载体microRNAsmiR-let-7atransforming growth factor beta receptor 3luciferase reporter vector
医学主题词
荧光素(Fluorescein)基因(Genes)受体, 转化生长因子β(Receptors, Transforming Growth Factor beta)突变(Mutation)转染(Transfection)
分类号
R73（肿瘤学）
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.001
发布时间
2017-06-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（81673643）
浙江省科技厅公益性技术应用研究计划（2012C23066）
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