换一批野生型p27和核定位信号缺失型p27真核表达载体的构建及表达
Construction and expression of the eukaryotic expression vector of wild-type p27 and lacking the nuclear localization signal p27
摘要目的 构建人野生型p27(p27WT)和核定位信号缺失型p27(p27△NLS)的真核表达载体,并在HEK293T细胞中进行表达,为细胞中p27核浆定位的变化及其不同的生物学功能研究提供细胞基础.方法 提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录cDNA后,分别进行p27全长和非NLS区片段的PCR扩增,获得p27WT全长(CDKN1B,NM_004064.5)和p27△NLS编码区序列,分别将其克隆至真核表达载体pCMV-Blank,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定.电穿孔法转染HEK293T细胞,48 h时分别提取胞核蛋白和胞质蛋白,Western blotting检测p27在细胞质和细胞核中的蛋白表达.结果 测序结果显示,真核表达载体pCMV-Blank中插入的p27WT序列和p27△NLS序列均与NM_004064.5序列相一致.pCMV-p27WT转染HEK293T细胞后,细胞总p27蛋白表达显著增加,核浆分离检测发现其在细胞质和细胞核中均表达;而pCMV-p27△NLS转染HEK293T细胞的总p27蛋白表达也显著增加,核浆分离检测发现其主要在细胞质中表达.结论 成功构建人p27WT和p27△NLS的真核表达载体,并在HEK293T细胞中成功表达,为p27蛋白在肿瘤细胞周期中的功能研究提供了细胞基础.
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分类号
R393（基础医学）
栏目名称
DOI
10.7652/jdyxb202204006
发布时间
2022-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（No.81872272）
陕西省重点研发计划资助项目（No.2015SF015）
陕西省重点研发计划资助项目（2019SF-147）
西安交通大学第一附属医院基金资助项目（No.2019ZYTS-13）
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