换一批人促甲状腺激素受体A亚单位蛋白在昆虫细胞体系中的分泌性表达
Secretory expression of human thyroid stimulating hormone receptor A subunit in sf9 insect cell system
摘要目的 拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hor-mone receptor,TSHR)A亚单位蛋白.方法 将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因连接到质粒,并通过转化、蓝白斑筛选获得重组杆粒,将其转染入 sf9 昆虫细胞收获重组杆状病毒,扩增并测定滴度.最终通过蛋白印迹实验鉴定重组蛋白的表达并优化表达条件.结果 在蛋白表达体系的构建过程中,PCR鉴定和测序均证实了重组质粒和重组杆粒序列的正确性.将重组杆粒转染入细胞后观察到病毒出芽迹象,空斑实验鉴定P1 代病毒的滴度为 2×107 pfu/m.蛋白印迹显示重组蛋白分子质量为 55 ku,主要在培养基中.蛋白表达的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为 1,最佳感染时程为 72 h.结论 本研究构建了TSHR A亚单位的昆虫细胞杆状病毒表达体系,该体系能够外泌性表达分子质量为 55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能够成功的糖基化修饰.该系统为其工业化平台的建设及生产提供前期基础,也针对日后 TSHR 蛋白的研究和 Graves病的病因预防提供了有用的工具.
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