利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究

Study on the preparing of polyclonal antibodies against plant-selected maker gene hpt expression protein by DNA immunization

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摘要目的: 制备转基因作物中选择标记基因潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase, hpt)基因表达产物的多克隆抗体, 并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制.方法: 以hpt的cDNA全长插入真核表达载体pCDNA3中, 并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定. 以纯化的重组质粒pCDNA3-HPT免疫BALB/c小鼠.用在E.coli中表达并纯化的(His)6-HPT进行ELISA, 检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况, 并用Western blot检测抗血清的特异性.结果: 经3次核酸免疫后, 小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体.第4次加强免疫时, 将小鼠分为3组, 每组两只.第1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫, 第2组用 (His)6-HPT融合蛋白免疫, 第3组仍用原来提取的重组质粒免疫.结果发现, 第1组小鼠抗血清的效价有所上升, 经ELISA检测达1∶200; 第2组抗血清的滴度显著升高, 达到1∶2 000; 而第3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体.Western blot证实, 前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST-HPT、(His)6-HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合.结论: 用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体, 但抗体效价不够理想.推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水平有关,可望通过调整影响核酸免疫的其他多种因素提高抗体的水平.