换一批
换一批摘要目的:构建藏羚羊大脑皮质组织的cDNA文库并鉴定文库质量.方法:提取藏羚羊大脑皮质组织总RNA,经oligotex试剂盒纯化得到mRNA.利用SMART技术,使用含有Sfi I B酶切位点的oligo(dT)引物和含有Sfi I A酶切位点的SMART Ⅳ寡核苷酸在PowerScript逆转录酶作用下运用mRNA 5'末端的模板转换方法合成cDNA第1链.利用LDPCR扩增cDNA,经Sfi I(Ⅰ A和Ⅰ B)酶切后,通过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离去除＜500 bp的片段,再同经Sfi I酶切的λTrip IEx2载体连接,体外包装后转染到大肠杆菌XL1-Blue宿主菌中,进行文库滴度和重组率的测定,然后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑行PCR反应鉴定插入片段大小.结果:构建的cDNA文库滴度为1.8×109 pfu/L,重组率＞98%,文库扩增后滴度达8×1012 pfu/L,插入片段长度在750～6000 bp之间,平均长度为4250 bp.结论:文库具有良好的质量,为进一步筛选、克隆藏羚羊大脑皮质组织特异表达基因奠定了基础.
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