小鼠抗西方马脑炎病毒E2蛋白胞外区(E2ecto)单克隆抗体的制备

Preparation of mouse monoclonal antibodies against the ectodomain of Western equine encephalitis virus E2(E2ecto)protein

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摘要目的制备针对西方马脑炎病毒(WEEV)E2包膜糖蛋白胞外区(E2ecto)的小鼠特异性单克隆抗体(mAb).方法构建表达WEEV E2ecto的原核表达质粒pET-28a-WEEV E2ecto,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,主要为包涵体形式.包涵体纯化后,通过变性、复性、超滤等制备得到E2ecto蛋白;以QuickAntibody-Mouse5W为佐剂,将E2ecto蛋白肌肉免疫BALB/c小鼠,间隔21 d加强1次.免疫后35 d,取效价超过1 × 104的小鼠腹腔接种1次E2ecto蛋白,3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合.通过有限稀释法筛选稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,接种小鼠腹腔后制备腹水;利用ELISA检测抗体亚型及腹水中抗体效价的水平;将真核表达质粒pCAGGS-WEEV-CE3E2E1转染BHK-21细胞,通过免疫荧光法(IFA)鉴定上述mAb的生物学活性;利用东方马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的E2ecto蛋白进行ELISA鉴定上述抗体的特异性.结果成功表达及复性获得了纯化的WEEV E2ecto蛋白;制备了 3G6G10、3D7G2、3B9E8、3D5B7四株mAb,其亚型分别为 IgG2c(κ)、IgM(K)、IgM(κ)、IgG1(κ);3G6G10、3B9E8、3D7G2 腹水抗体效价均为 105,3D5B7 达到 107;该 4 株抗体与VEEV和EEEV等其他脑炎甲病毒无交叉反应.结论成功制备了 4株特异性结合WEEV E2ecto的小鼠mAb.