比利时杜鹃花RhDFR基因克隆及分析

Cloning and Analysis of RhDFR Gene in Rhododendron hybridum Hort

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摘要二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是植物花青素合成过程中的关键酶,能够催化二氢黄酮醇生成无色花青素.该试验以红色和白色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同器官和不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhDFR基因,利用植物酶联免疫试剂盒(ELISA)测定不同发育时期的花瓣RhDFR酶活性,利用qRT-PCR技术定量分析不同器官和不同发育时期的花瓣RhDFR基因,构建pET-28a-RhDFR原核表达载体对RhDFR蛋白进行制备和纯化,为进一步探究杜鹃花DFR基因功能以及花色的分子机理奠定基础.结果表明:(1)成功获得比利时杜鹃花RhDFR基因全长1253 bp,其开放阅读框1035 bp,编码344个氨基酸,含有1个NADPH结合保守基序和1个底物结合区域,具有高度保守性;系统进化分析显示,比利时杜鹃花RhDFR蛋白与越橘(Vaccinium corymbosum)DFR蛋白亲缘关系最近.(2)ELISA试剂盒分析显示,比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣DFR酶活性呈先上升后下降的趋势,并于红花初开期和白花盛开期的DFR酶活性最高.(3)qRT-PCR分析显示,不同器官中RhDFR基因的表达量为花瓣最高,雄蕊最低;不同发育时期的花瓣中,红色花的RhDFR基因表达量高于白色花.(4)成功构建原核表达载体pET-28a-RhDFR并诱导表达出大小约为38 kD的蛋白,与理论值相近.研究认为,杜鹃花中DFR酶活性的功能多样化,DFR基因与比利时杜鹃花花瓣的颜色有关.