换一批
换一批糖尿病的基因治疗技术:大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定
Gene therapy for diabetes mellitus:construction and identification of eukaryotic cell expression plasmid in rat proinsulin gene
摘要目的:构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒 pCMV/proinsulin并进行序列测定.方法:实验选用雄性 SD大鼠 1只,从大鼠胰腺组织中提取总 RNA,通过 RT-PCR法获得胰岛素原基因 cDNA全长序列,并采用现代分子生物学技术,借助真核细胞表达质粒 pCMV-Script vector具有多克隆酶切位点的特点,选择适当的限制性酶切位点( EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ),并使大鼠胰岛素原基因 cDNA两端带有相同的酶切位点,利用其黏性末端进行定向克隆,从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒 pCMV上.结果:经 RT-PCR法扩增并通过 DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因.经 PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子,并进一步进行 DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法),确定其序列与目的基因序列完全一致.结论:成功构建重组质粒 pCMV/proinsulin,为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞,使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础.
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