摘要目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒.方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成.①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒.②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA的表达.结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作Xho I/Mlu I和Xba I/Not I双酶切,经10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2 kbp的人骨形成蛋白2条带和592 bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置.经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变.②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165 mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48 h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应.结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2 kbp及592 bp两条带.证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA.结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础.