摘要背景:通过体外培养人角膜缘干细胞并进行传代、建系研究可为角膜缘干细胞移植的基础与临床研究提供足够的细胞储备.目的:探讨一种体外培养人角膜缘干细胞传代、建系的方法.设计:随机对照观察.单位:赣南医学院.材料:实验于2003-06/2004-04在赣南医学院科研中心与中山大学医学院眼科医院国家重点实验室完成.新鲜人角膜缘组织块分别取自2名健康人角膜组织供体,均经过供体者知情同意.RPMI-1640(Sigma R8755,含L-谷氨酰胺),200 g/L胎牛血清(Gibco 16140-071).DMEM培养基、硫酸软骨素、人表皮生长因子购自美国Sigma公司,HEPES、DMSO购自美国Gibco公司,100%甘油购自上海运佳黄浦制药有限公司,戊二醛购自德国E.Merk公司,乙醇、盐酸、丙酮、甲醛等购自北京化学试剂公司,0.25%胰蛋白酶液购自上海新华制药厂,上述试剂均为分析纯级.方法:人角膜缘深部色素区组织块经消化后,分别在含有RPMI-1640、200 g/L胎牛血清的培养瓶与以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中进行体外培养.光镜及扫描电镜观察原代及传代培养细胞的生长情况;采用台盼蓝排斥实验计算冻存细胞逐代冻存处理后的复苏率.主要观察指标:①人角膜缘干细胞体外原代及传代培养观察结果.②细胞冻存复苏率.结果:①原代培养结果:经PRMI-1640培养基中培养1 d后,倒置相差显微镜下可见培养瓶中细胞多已贴壁,均匀稀疏排列成单层并贴于培养瓶底部.②传代培养结果:传第2代时添加人表皮生长因子后,细胞分散成单层,贴壁生长旺盛.所有细胞传至第30代后形态的变异性增加明显,细胞体积明显增大,形态呈圆形或不规则圆形,密集成群.在培养液中传33代后,细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力,并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长.③细胞冻存复苏率:冻存细胞的复苏率为82.2%.结论:将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系,人角膜缘干细胞更适合在含有羊膜细胞外基质为底物的培养基中生长.