摘要背景:LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白,主要在骨的钙化阶段起作用.目前发现LMP-1可以促进骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1等多种蛋白质合成增加,提示其可能通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化.目的:应用AdEasy腺病毒载体系统构建人LMP-1基因的腺病毒重组体,并检测感染病毒的兔骨髓间充质干细胞LMP-1的表达.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-03/2007-02在解放军第三军医大学西南医院中心实验室完成.材料:纯种新西兰大白兔3只,用于分离制备骨髓间充质干细胞.携带人LMP-1基因的plRES2-EGFP-LMP-1质粒由重庆医科大学附二院骨科保存;AdEasy腺病毒由美国Tong-Chuan He博士惠赠:人胚肾293细胞由重庆医科大学检验系王宏兵硕士惠赠.方法:以plRES2-EGFP-LMP-1质粒为模板进行PCR扩增,在下游引物中加入特定序列,使扩增出的LMP-1基因带有编码6个组氨酸(即His标签)的碱基序列,将其作为目的基因,TA克隆后测序.双酶切后插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV内,经Pme I线性化,在BJ5183菌内与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1.通过脂质体介导在HEK293细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,扩增纯化后测定滴度,以最佳MOI值体外感染兔骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot法检测LMP-l表达.主要观察指标:重组腺病毒质粒pAd-LMP-l的鉴定,检测其滴度及感染效率.RT-PCR、Western Blot法检测感染细胞LMP-1mRNA及蛋白的表达.结果:[1]测序鉴定携带His标签的LMP-1基因的重组质粒pMDl8-T-LMP-1构建成功.包装扩增后获得滴度约3.5×109efu/mL的腺病毒重组体Ad-LMP-1.以150的MOI值感染兔骨髓间充质干细胞可以获得最佳感染效率,感染3d后达50%~70%. [2]病毒感染后的骨髓间充质干细表达LMP-1mRNA及蛋白.结论:成功构建携带His标签的人LMP-1基因的腺病毒重组体,证实感染重组病毒的骨髓间充质干细胞可有效表达LMP-1.