新生大鼠前软骨干细胞株的体外培养分选、鉴定及永生化研究

Separation,identification and immortalization of precartilaginous stem cells from neonatal rats

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摘要背景:前软骨干细胞虽然具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,但生物学性状不稳定,易分化.导入外源性基因能使其永生化,且不改变细胞的表型和性状.目的:建立永生化大鼠前软骨干细胞株,为以后精确调控前软骨干细胞的增殖与分化打下基础.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-10/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.材料:出生＜24 h的新生SD大白鼠,雌雄不限,用于取前软骨干细胞.方法:用LipofectamineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代前软骨干细胞进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养.主要观察指标:①前软骨干细胞的生物学性状.②质粒鉴定.③用免疫细胞化学方法和反转录聚合酶链反应鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达.④反转录聚合酶链反应结果.⑤细胞生长曲线.结果:①免疫磁珠分离获得细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性.②双酶切质粒,电泳证实pCMV为3 kb,SV40T基因为2.3 kb.③嘌呤霉素分离获得转化后细胞阳性克隆,用免疫组织化学证实FGFR-3表达阳性.④提取RNA后用反转录-聚合酶链反应法成功扩增出588 bp的片段.转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞.⑤贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77) h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响.结论:在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端中分离、培养出前软骨干细胞.pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化.