换一批
换一批pIRES2-EGFP-gAd质粒载体构建及在大鼠肾脏的表达
Construction of eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-gAd and its expression in rat kidneys
摘要背景:已有研究证实经腹腔注射基因转染肾脏是一种简便有效的实验方法.目的:构建表达球形脂联素(gAd)的pIRES2-EGFP-gAd质粒,观察其在大鼠肾脏的表达.方法:以pET/gAd质粒为模板,PCR扩增目的片段,转化大肠杆菌,用EcoR Ⅰ BamH Ⅰ双酶切后,与pIRES2-EGFP荧光质粒连接,重组构建pIRES2-EGFP-gAd质粒.将构建成功的pIRES2-EGFP-gAd质粒采用脂质体介导经腹腔注射正常大鼠体内,于注射24,48,96 h和7 d留取肾脏标本进行冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在肾组织中的表达,同时采用Western bot检测肾组织绿色荧光蛋白的表达.结果与结论:重组构建的pIRES2-EGFP-gAd载体经双酶切电泳分析及DNA测序证实无碱基突变.在腹腔注射脂质体/pIRES2-EGFP-gAd转染复合物24 h,即可在肾小球肾间质检测到绿色荧光,注射48 h,荧光进一步增强,之后逐渐减弱,至注射7 d时,荧光强度明显减弱.Western bot检测的绿色荧光蛋白的表达结果与冰冻组织切片结果一致.说明脂质体能够介导pIRES2-EGFP-gAd真核载体在大鼠肾脏表达.
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