换一批提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法
An improved method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells with high yield and purity
摘要背景:由于小鼠肝脏小、血管较细,其原代肝星状细胞分离的难度相对较大,且得率有限,难以满足体外实验需求.目的:建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法,提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度,为研究肝纤维化的机制奠定实验基础.方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏,再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/LⅣ型胶原酶灌注,使用Nycodenz进行梯度密度离心,获取中间层原代肝星状细胞,锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力,流式细胞法检测细胞纯度,免疫荧光法检测Desmin表达,并于倒置显微镜下观察细胞培养3,5,7 d后的形态变化,PCR法检测培养3,5,7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况.结果与结论:①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞(5.5±0.4)×106个,锥虫蓝检测细胞活力均大于95%,流式细胞法检测细胞纯度为94%,免疫荧光检测细胞高表达Desmin;②随着体外培养时间的延长,可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展;③随培养天数增长,α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高;④结果提示,实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法,可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案,也为肝纤维化的机制研究提供技术保障.
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分类号
R394.2
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.2095-4344.0903
发布时间
2018-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金重点项目（81530101）；
国家自然科学基金项目（81703681）；
上海市青年科技英才扬帆计划资助项目（17YF1419800）；
中国博士后科学基金资助项目（2016M601643）
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