摘要背景:巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子,可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移.课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF,且在培养液中浓度基本固定.然而,MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚.目的:探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用.方法:①培养人胚胎干细胞H9,CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平.②为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,分为:对照组,细胞在干细胞培养基中正常培养;外源性MIF组,在干细胞培养基中分别添加30,100,300 ng/mL的MIF;MIF抑制剂ISO-1组,在干细胞培养基中分别添加2,7,21 μmol/L的ISO-1;MIF+ISO-1组,在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/mL MIF,采用CCK-8法检测上述各组细胞活力.③为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,采用CRISPR-Cas9技术构建MIF敲除的H9细胞系,观察建系情况.④为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响,在培养基中分别添加100 ng/mL MIF和100 ng/mL CXCR4中和抗体,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平.结果与结论:①人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d,正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/mL,与细胞量无关;②与对照组相比,添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P>0.05);ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖,ISO-1浓度越大,抑制越明显(P<0.05);ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P<0.05);③RT-qPCR检测MIF基因敲除约50%后,人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功;④在培养基中添加100 ng/mL外源性MIF,自我更新转录因子KLF4的mRNA、蛋白及荧光表达水平均下降;分化因子FOXA2的mRNA、蛋白及荧光表达水平均上升;⑤在培养基中添加100 ng/mL CXCR4中和抗体,KLF4的mRNA及蛋白表达水平均上升;FOXA2的mRNA及蛋白表达水平均下降,与MIF组表达趋势相反.综上所述,人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的;培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖,但可以使自我更新因子KLF4表达下降,转录因子FOXA2表达上升,为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索,MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用.