摘要背景:近年来,外泌体作为细胞间信息传递的关键递质,在骨质疏松的发生、进展及治疗中发挥重要作用,外泌体携带的miRNA和蛋白质等活性分子可调控成骨细胞与破骨细胞功能,影响骨代谢平衡,但具体机制尚需进一步研究.目的:利用4D-DIA蛋白质组学、多种机器学习算法、孟德尔随机化分析鉴定和验证骨质疏松相关外泌体核心基因并探讨免疫调控机制,预测潜在的靶向药物,为骨质疏松的机制研究和精准治疗提供新思路.方法:将12只SD大鼠分为假手术组、骨质疏松模型组,每组6只,采用卵巢切除法造模完成后取大鼠股骨组织进行4D-DIA蛋白质组学检测,鉴定差异基因,同时进行加权基因共表达网络分析.从GEO整理GSE56815和GSE7158表达谱作为验证数据集.从Gene Cards数据库下载外泌体相关基因,将其与蛋白组学的加权基因共表达网络分析模块基因、验证数据集差异基因取交集获得骨质疏松-外泌体相关基因,并进行功能富集分析.随后利用随机森林、LASSO回归和支持向量机3种机器学习算法分别筛选特征基因并取交集,以获得骨质疏松-外泌体核心基因,进一步建立预测模型并进行受试者工作特征曲线验证.采用CIBERSORT进行免疫浸润分析免疫细胞亚群在骨质疏松中的表达差异,采用单样本基因富集分析骨质疏松-外泌体核心基因与免疫细胞亚群间的关联性,同时分析核心基因的相关生物学通路.通过StarBase数据库预测骨质疏松-外泌体核心基因结合蛋白调控网络.最后,通过两样本孟德尔随机化验证外泌体核心基因与骨质疏松的因果关系,通过药物特征数据库进行药物富集分析,利用CB-DOCK2网站进行分子对接可视化.结果与结论:①4D-DIA蛋白质组学获得1 322个骨质疏松差异蛋白,加权基因共表达网络分析筛选出2个特征模块含402个基因,Gene Cards数据库整理出878个外泌体相关基因,GEO验证数据集差异分析获得4 447个差异蛋白,三部分基因取交集获得的31个基因为骨质疏松-外泌体相关基因;②相关基因的功能富集分析结果显示主要与中性粒细胞胞外陷阱的形成、Ras相关蛋白1信号通路、焦点黏附斑有关;③3种机器学习算法鉴定出4个骨质疏松-外泌体核心基因,其中在动物模型和GEO验证数据集中差异表达相同的有2个基因:ITGB3、SERPINA1.受试者工作特征曲线显示ITGB3、SERPINA1在动物模型、GEO验证数据集中皆具备较高的曲线下面积值,单个基因或2个基因组成的模型曲线下面积值皆大于0.9;④免疫浸润基因富集分析结果显示ITGB3、SERPINA1的高表达与M1型巨噬细胞呈正相关性,ITGB3、SERPINA1的高表达与NOD样受体信号通路有关;⑤基因结合蛋白调控网络显示ITGB3、SERPINA1共同调控HNRNPC、G3BP1、EIF3D、CTCF、U2AF2、MDTH等10个RNA结合蛋白;⑥两样本孟德尔随机化分析结果显示SERPINA1对骨质疏松表现出抑制作用,是骨质疏松的保护因素;⑦SERPINA1的药物富集分析结果显示有36种药物的P值<0.05,分子对接发现有9种药物的结合能小于-29.4 kJ/mol,其中β-胡萝卜素与SERPINA1的结合能最强(-35.28 kJ/mol).上述结果显示,ITGB3、SERPINA1是骨质疏松-外泌体核心基因,通过参与特定免疫过程、调控NOD样受体信号通路在疾病进展中发挥关键作用,对骨质疏松的诊断具有精准预测效果.