摘要目的 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)目前已逐渐成为威胁人类生活健康的最常见的肝病之一,然而其发病机制尚未完全阐释清楚,近期有研究表明在非酒精性脂肪肝病存在异常表达的piRNAs,其中piRNA-DQ723301可能通过靶向调控Smad2参与非酒精性脂肪肝病的发生发展,但其靶向作用及具体机制尚未被完全阐明.因此,本实验的目的旨在研究piRNA-DQ723301与Smad2是否存在靶向调控,从而参与NAFLD的发生发展,以不断完善piRNA在NAFLD发病机制中的作用奠定理论基础.方法 1.设计含有piRNA-DQ723301结合位点的Smad2 3'-UTR PCR引物,通过双荧光素酶实验分析得出piRNA-DQ723301对Smad2的靶向调控作用.2.通过CCK8法检测,比较转染不同浓度piRNA-DQ723301模拟物及抑制剂48h后各组细胞的活力,通过比较得出较合适的浓度.3.Smad2 mRNA及蛋白、piRNA-DQ723301的表达情况通过Western-blot法、实时荧光定量PCR分析.并观察piRNA-DQ723301对非酒精性脂肪肝纤维化发病关键因子的影响.结果 1.将构建的阴性对照序列、质粒、模拟物共同转染至293T细胞,针对荧光素酶活性进行检测.表明与对照组相比,piRNA-DQ723301以野生型质粒为载体时,酶活性能受到抑制;而以突变型质粒为载体时,荧光素酶酶活性则无明显改变,且 piRNA-DQ723301类似物野生质粒组荧光素酶活性比piRNA-DQ723301类似物突变型质粒组组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01).2.CCK8法结果表明,小鼠原代肝星状细胞活力在转染100 nM、150 nM的模拟物、抑制剂后分别呈现出下降、增强趋势,转染50 nM的模拟物、抑制剂及各浓度的对照序列则基本不变.3.相较于未转染组,转染组piRNA-DQ723301表达量、Smad2 mRNA表达量、a-SMA mRNA在NC组、Mimic组、Inhibitor组分别呈现出基本不变、显著增高(P＜0.001)、明显降低(P＜0.001)的变化趋势.4.相较于未转染组,各转染组Smad2蛋白的表达量在NC组、Mimic组、Inhibitor组的变化趋势分别为基本不变、显著降低(P＜0.001)、明显升高(P＜0.001);Piwi蛋白的表达量在NC组、Mimic组、Inhibitor组的变化趋势分别为基本不变、Piwi13基本不变及Piwil1、Piwil2、Piwil4 显著增高(P＜0.01)、Piwi13 基本不变及 Piwil1、Piwil2、Piwil4 降低(P＜0.05).与 Inhibitor 组相比,Mimic 组 Piwi 表达量增加(P＜0.01),Smad2表达量降低(P＜0.001).5.与未转染组比较,TGF-β1、a-SMA蛋白表达量在NC组、Mimic组的变化趋势分别为基本不变、显著降低(P＜0.001),Inhibitor组则显著上升(P＜0.001).结论 1.piRNA-DQ723301针对Smad2的表达具有靶向调节作用,能够抑制其表达;2.piRNA-DQ723301可靶向调控Smad2抑制肝星状细胞活力及功能;3.利用piRNA-DQ723301的靶向调控作用或可对肝纤维化的发生发展产生抑制甚至逆转作用.