利用CRISPR-Cas9技术构建微小核糖核酸-551b基因敲除小鼠模型

Construction of miR-551b gene knockout mice by CRISPR-Cas9 technique

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摘要目的:利用成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)相关蛋白 9(CRISP associated protein 9,Cas9)技术构建微小核糖核酸-551b(miR-551b)基因敲除小鼠模型.方法:选择健康C57BL/6J小鼠,针对miR-551b外显子1区域,设计导向RNA(guide RNA,gRNA),构建Cas9载体质粒,将体外转录的Cas9 RNA及gRNA显微注射入小鼠的受精卵并体外培养.将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待小鼠生育后得到F0代小鼠,使用基因测序确定基因敲除情况,与野生型小鼠繁育后,得到Fl代杂合小鼠,Fl代小鼠经自交繁育获得F2代小鼠,F3代小鼠由F2代纯合小鼠自交获得,采用电泳鉴定小鼠基因型,RT-PCR检测F3代小鼠组织miR-551b的表达.结果:利用CRISPR/Cas9技术构建模型小鼠得到F0代小鼠,通过测序筛选出缺失目标序列的F0代杂合子小鼠.与WT小鼠繁育后,琼脂糖凝胶电泳及测序筛选出F1代杂合小鼠,同样的方法鉴定并获得F2、F3代基因敲除小鼠,获取F3代纯合小鼠的心脏及下腔静脉样本,RT-PCR结果证实F3代纯合小鼠miR-551b表达明显低于WT小鼠(P＜0.05),成功敲除miR-551b基因.结论:通过CRISPR-Cas9技术成功构建miR-155基因敲除小鼠模型并稳定遗传,为进一步研究提供了有利条件.