摘要目的 探讨自噬接头蛋白(Sequestosome 1,SQSTM1/p62)与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)复合物的结合蛋白 WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)在空间上定位的调控关系.方法 使用CRISPR-Cas9技术敲除正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney,NRK)中的自噬相关基因 2A(Autophagy-related gene,Atg2A)、自噬相关基因 2B(Autophagy-related gene,Atg2B)和p62 基因,建立 Atg2A 和 Atg2B 基因敲除的细胞系(Atg2ABdouble knockout,Atg2ABDKO)以及p62基因敲除细胞系(p62knockout,p62KO);透射电镜观察Atg2AB DKO细胞中p62体周围囊泡的定位;活细胞成像观察Atg2AB DKO细胞内p62体与 自噬相关蛋白WIPI2的定位变化;光漂白实验观察相变蛋白p62与WIPI2的荧光漂白恢复;通过免疫荧光观察WT、p62 KO和Atg2AB DKO细胞中WIPI2与p62的定位关系;通过蛋白免疫印记检测 WT和p62 KO细胞中WIPI2表达量的变化.结果 建立了 Atg2AB DK O和p62 KO细胞系;透射电镜显示Atg2AB DKO细胞中p62附近聚集了大量囊泡;在Atg2AB DKO中,通过活细胞成像观察到tdTomato-p62与WIPI2-GFP高度共定位;荧光漂白实验观察到 WIPI2具有流动性;通过免疫荧光观察到,与 WT细胞相比,在Atg2AB DKO中WIPI2点的数量明显增多(P＜0.000 1);与 WT细胞相比,p62 KO细胞中WIPI2点的数量和表达量无明显变化(P＞0.05).结论 无膜细胞器p62能够与具有流动性的WIPI2阳性囊泡动态融合,促进自噬体的形成.