换一批基于高分辨率熔解曲线检测MD肿瘤微卫星不稳定性
Detection of Microsatellite Instability in Marek's Disease Tumor based on High-resolution Melting
摘要本研究旨在通过高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)方法检测马立克病(Marek's disease,MD)肿瘤中存在的微卫星不稳定现象(microsatellite instability,MSI).通过临床症状、病理剖检、组织病理学、PCR及测序确定为马立克病.采集5只发病鸡的肌肉、肝、脾、血液及肿瘤组织,提取DNA,采用15对扩增微卫星DNA序列的引物进行HRM检测,得到归一化处理的差异熔解曲线,比较分析各组织熔解曲线的差异,分析15个微卫星标记是否存在基因突变(即MSI).结果表明,发病鸡的各种临床、病理表现符合为马立克病的特征,病毒meq基因序列与近年来国内流行的MDV强毒株有较高的同源性.HRM分析结果显示,MD发病鸡的肌肉、肝、脾、血液、肿瘤组织中微卫星标记PCR扩增后的熔解曲线存在明显的差异,即存在MSI现象,而且不同的病鸡个体和不同的微卫星标记发生MSI的频率不同.15个微卫星标记在5只鸡的病料中存在MSI的微卫星标记的个数分别为14、7、5、3和1.在15个微卫星标记中,MCWO200、MCW0220这两个微卫星标记在所有的病鸡中都存在MSI,而ADL0158微卫星标记在所有的病鸡中都不存在MSI.通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序分析进一步证明这些微卫星PCR扩增片段确实存在片段大小不同,碱基序列中存在微卫星重复单位的增多、减少或基因片段的插入或缺失.结果提示,通过HRM分析可以检测MD肿瘤中的MSI现象,是一种灵敏、准确、简便、高通量的方法.
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