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B亚型禽偏肺病毒B1分离株感染性克隆的构建与鉴定

Construction and Identification of Infectious Clone of the Avian Metapneumovirus of Subtype B Strain B1

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摘要B亚型禽偏肺病毒(avian metapneumovrus,aMPV)可引起鸡肿头综合征,造成免疫抑制,引发严重的继发感染并导致鸡生产性能下降.建立国内aMPV分离株的反向遗传学系统对病毒研究及开发针对性疫苗具有重要意义.将病毒基因组扩增片段分别测序,通过序列拼接获得了完整的aMPV B1分离株基因组序列.根据病毒基因组序列中的酶切位点,将基因组分4段依次连入pTH载体,获得病毒基因组质粒pTH-B1.在病毒基因组的第7 474位引入同义突变,沉默原有Sal Ⅰ酶切位点以作为遗传标记,在pTH-B1质粒M与F基因之间引入Pme Ⅰ酶切位点,并利用该位点插入EGFP基因,获得质粒pTH-B1EGFP.将病毒N、P、M2.1基因的表达盒共同克隆到pCI-Neo表达载体中,获得辅助质粒pCI-NPM2.1.将L基因单独克隆到pCI-Neo表达载体中,获得辅助质粒pCI-L.将pTH-B1质粒和pTH-B1EGFP质粒分别与两种辅助质粒共转染BSR/T7细胞,然后将转染细胞与Vero细胞共培养并连续传代.结果显示:通过细胞病变(CPE)和绿色荧光观察,以及N基因和遗传标记检测、间接免疫光试验(IFA)和Western blot共同验证,表明构建的rB1株和rB1-EGFP株拯救成功.rB1株和rB1-EGFP株与亲本毒株的增殖水平和趋势相似.本研究通过三质粒拯救系统获得了 B亚型aMPV B1株的感染性克隆,M和F基因间的非编码区可插入基因表达序列,为进一步探究B亚型aMPV的致病机理和疫苗研发奠定了必要基础.

作者于泽坤 ^[1] 姜承源 ^[2] 袁洪兴 ^[3] 周生 ^[2] 段笑笑 ^[4] 李彦 ^[4] 宋勤叶 ^[5] 学术成果认领

作者单位河北农业大学动物医学院,保定 071000;山东信得科技股份有限公司,潍坊 262200 ^[1] 山东信得科技股份有限公司,潍坊 262200 ^[2] 河北省邯郸市馆陶县农业农村局,馆陶 057750 ^[3] 青岛市动物疫病预防控制中心,青岛 266100 ^[4] 河北农业大学动物医学院,保定 071000 ^[5]

关键词 B亚型禽偏肺病毒感染性克隆三质粒病毒拯救 avian metapneumovirus subtype B infectious clone a three-plasmid rescue system viral rescue

分类号 S852.659.5

栏目名称

预防兽医

DOI 10.11843/j.issn.0366-6964.2025.02.028

发布时间 2025-03-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

基金项目

青岛市科技惠民示范专项项目（23-2-8-xdny-14-nsh）