摘要本研究旨在开发一种猪瘟E2纳米颗粒疫苗,并对其免疫原性进行分析.以猪瘟病毒石门株E2基因序列为模板,对其胞外域进行人源密码子优化,通过293F哺乳动物细胞真核表达系统制备E2、E2-pFc(E2与猪源抗体的Fc片段融合表达)、SpyTag-E2(E2与SpyTag融合表达)以及纳米骨架蛋白LS(lumazine synthase-protein A),原核表达系统纯化纳米骨架蛋白mi3(mi3-SpyCatcher),进一步组装成纳米颗粒LS-E2-pFc NP和mi3-E2 NP,并通过透射电镜和动态光散射试验进行鉴定,各组蛋白分别与ISA201佐剂乳化,制备亚单位疫苗.选用1.5～2.0 kg重的日本长耳大白兔35只,随机分为7组,包括空白对照组(n=3)、PBS阴性对照组(n=3)、E2组(n=5)、E2-pFc组(n=5)、LS-E2-pFc NP 组(n=5)、mi3-E2 NP 组(n=5)和 CSFV E2 商业化亚单位疫苗组(n=3).于 0、21 d 进行肌肉注射免疫,42 d将CSFV C株经耳缘静脉按照100 RID50·只-1进行攻毒,通过阻断ELISA、中和试验、体温监测和RT-qPCR等试验评估兔的特异性抗体水平、中和抗体水平、兔体定型热反应以及脾脏病毒载量.结果显示,各组分蛋白成功表达,纯化后的蛋白条带单一,纯度较高.透射电镜可观察到粒径在10～70 nm的纳米颗粒结构,动态光散射试验观察到mi3-E2平均粒径(68 nm)大于mi3(42.73 nm),LS-E2-pFc平均粒径(42.4 nm)大于LS(13 nm).免疫试验结果表明,E2、E2-pFc、LS-E2-pFc NP、mi3-E2 NP疫苗和商业化亚单位疫苗均有良好的免疫效果,攻毒前7 d,血清中特异性抗体阻断率均在89％以上,组间差异不显著(P＞0.05).攻毒后,PBS阴性对照组出现典型的兔体定型热反应,其余免疫组的体温变化不明显;攻毒后7 d,E2、E2-pFc、LS-E2-pFc NP、mi3-E2 NP疫苗和商业化亚单位疫苗组的中和抗体效价分别为1∶10 392.4、1∶37 168.4、1∶75 473.6、1∶20 201.8、1∶2 407,其中,LS-E2-pFc NP组的中和抗体水平最高.RT-qPCR结果显示,E2组有一只兔检出低拷贝的病毒载量,拷贝数为5.83 copies·μL-1,其余免疫组未检到病毒载量.以上结果显示LS-E2-pFc NP免疫组效果最好,中和抗体水平最高.这种"标记"疫苗可以对自然感染和免疫接种的动物进行鉴别诊断,有助于猪场净化猪瘟.