换一批基于纳米孔测序的十种猪病原检测方法的建立
Establishment of Ten Swine Pathogens Detection Method based on Nanopore Sequencing
摘要旨在研究一套用于纳米孔靶向测序(nanopore targeting sequencing,NTS)的同时检测10种猪病原的引物组,并以此探索后续在此平台上检测全部猪病原的可能性.用Primer Premier 6软件设计10种病原的引物;用PCR及琼脂糖凝胶电泳方法验证10种引物的特异性;用纳米孔测序技术探索多重PCR体系中的最优引物浓度,通过比对各浓度梯度下的病原检出数量确定最优引物浓度;用纳米孔测序技术验证多重PCR的敏感性,用最优引物浓度对不同浓度梯度的病原模板进行扩增,确定检测敏感性;最后用临床样本(n=201)用荧光定量PCR对NTS进行符合性测试.结果显示:10种猪病病原引物特异,对其他10种猪病原均未扩出条带;反应体系中的引物终浓度在3和5 μmol·L-1时,能检测到模板中的10种病原;在加入5 μL浓度为9×102 copies·mL-1的核酸模板时,可检出4组重复中的所有阳性样本;在临床样本的检测上,NTS检测出的病原阳性数量更多.经卡方检验,两者对5种病原的检测结果存在统计学差异(P＜0.05),另5种不存在统计学差异(P＞0.05);经卡帕值分析,6种病原检测的一致性极好,4种较好.结果显示,NTS检测方法可以同时检测出10种不同的猪病原,对于两种检测方法结果不符合样本需经第三方检测方法进一步验证.
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