摘要本研究旨在建立具有稳定传代能力的野猪诱导多能干细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs),并将外源基因定点整合于iPSCs的X染色体,为野猪的资源保存和开发利用提供技术支撑.利用PiggyBac转座子系统将8种多能性因子导入野猪成纤维细胞,诱导建立iPSCs系,并鉴定其多能性;分别采用电转染(3种程序)、化学转染试剂 lipofectamine 3000(Lip 3000)和 jetPRIME 将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的质粒转入野猪iPSCs,通过流式细胞仪分析转染效率筛选最优转染方案;结合CRISPR/Cas9和不依赖于同源重组的定点整合技术,将筛选获得的高效sgRNA与GFP表达元件共转染野猪iPSCs,PCR扩增目的片段,并测序鉴定GFP的定点整合.本研究将人源OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、LIN28、NR5A2和miR302/367导入野猪成纤维细胞,诱导后20 d获得野猪iPSCs,其核型正常,碱性磷酸酶染色阳性,能稳定表达多能性因子OCT4、SOX2和NANOG,可体外形成拟胚体,并标记到三胚层的标志蛋白(βⅢ-微管蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和GATA6).对于不同的电转染程序,CG104程序的细胞转染效率为(9.73±0.23)％,显著高于CA201((7.34±0.03)％)和CB150程序组((6.69±0.10)％);而使用jetPRIME阳离子聚合物的细胞转染效率为(17.9±0.36)％,极显著高于Lip 3000((14.07±0.85)％).成功构建分别携带sgRNA与GFP表达元件的两个质粒,共转染野猪iPSCs后,PCR和测序结果显示,GFP表达元件定点插入至X染色体的预定位置,且能够稳定表达.本研究将野猪成纤维细胞诱导为可稳定传代的iPSCs,并通过不依赖同源重组的定点整合技术将GFP敲入iPSCs的X染色体,为野猪的基因编辑和家猪育种提供技术借鉴.