摘要本研究旨在可溶性原核表达伪狂犬病病毒(PRV)受体Nectin1蛋白的N端胞外结构域,并以此为靶标,筛选出高亲和力、高特异性的DNA适配体,为阻断伪狂犬病病毒吸附宿主细胞提供新的分子工具.将猪源Nectin1基因克隆至带有麦芽糖结合蛋白(MBP)促溶标签的原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-MBP-Nectin1,将双酶切鉴定和测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,使用Western blot和Pull-down试验验证重组蛋白.采用基于磁珠偶联的系统进化适配体筛选技术(SELEX)筛选特异性靶向rMBP-Nectin1 的DNA适配体,并利用磁珠ELASA检测筛选所得适配体Apt-Nectin1-6 的亲和力与特异性.以敲减Nectin1 蛋白的细胞系(sh-Nectin1-1、sh-Nectin1-2)为对照,应用流式细胞术验证Apt-Nectin1-6 对细胞表面Nectin1蛋白的结合能力,同时通过流式细胞术和基因组拷贝数试验评估其对PRV吸附细胞的抑制作用.Western blot和Pull-down结果表明重组MBP-Nectin1蛋白正确表达且具有生物学活性.通过SELEX技术筛选获得的适配体Apt-Nectin1-6 对rMBP-Nectin1 具有高亲和力,平衡解离常数(Kd)为(0.11±0.02)nmol,且不与rMBP-gD、rMBP-S1、rMBP-CD163及rMBP蛋白发生交叉反应.分子对接结果显示,Apt-Nectin1-6通过氢键与Nectin1结合.进一步流式细胞术、基因组拷贝数检测和病毒滴度测定结果显示,Apt-Nectin1-6可剂量依赖性地抑制PRV对细胞的吸附(P<0.05).本研究成功筛选得到可高特异性、高亲和力结合Nectin1蛋白的DNA适配体Apt-Nectin1-6,并证实其可有效阻断PRV对细胞的吸附,为开发新的抗PRV策略奠定基础.