摘要本研究旨在构建布鲁氏菌T4SS外膜核心复合体(VirB7、VirB9、VirB10)的重组表达体系,解析其结构特征,并进一步通过布鲁氏菌外膜核心区域结构缺陷菌株,探究该复合物在布鲁氏菌胞内存活及蛋白分泌中的功能机制.以猪种布鲁氏菌(Brucella suis S2株)为研究对象,通过同源性比对分析VirB7、VirB9、VirB10的保守性;利用Alpha Fold Server软件对布鲁氏菌T4SS外膜核心复合物三级结构预测;构建重组质粒pET28a-6hisVirB7-VirB10strepⅡ,经 Ni-NTA His-Tag 和 StrepⅡ-tag 两步纯化和凝胶过滤层析后进行 SDS-PAGE、Western blot 及 BN-PAGE验证表达;结合透射电子显微镜负染技术与单颗粒重构技术解析复合物的构象特征;通过布鲁氏菌外膜核心区域结构缺陷菌株S2ΔVirB9及小鼠巨噬细胞RAW264.7模型检测其胞内存活能力,利用TEM1报告系统检测蛋白分泌功能.结果显示:同源性分析结果表明,布鲁氏菌不同种属间VirB7、VirB9、VirB 10序列高度保守;三级结构预测显示,布鲁氏菌T4SS外膜核心复合物是包含直径183 ?外层(O-layer,O层)和直径140 ?内层(I-layer,I层)的异源十四聚体,其异三聚体亚基(VirB7、VirB9CTD和VirB10CTD)构象与已知同源结构相似.使用终浓度为0.25 mmol·L-1 IPTG于18 ℃诱导18 h后在C43(DE3)pLysS表达感受态细胞中成功表达并纯化出 VirB7、VirB9、VirB10复合物.透射电镜二维结构解析该复合物呈对称环形构象.进一步功能试验表明,结构缺陷株S2ΔVirB9在巨噬细胞中的存活能力显著降低(P＜0.001),且TEM1报告系统显示其蛋白分泌能力明显下降.本研究首次解析了布鲁氏菌T4SS外膜核心区域的环形结构特征,并通过功能试验证实该复合物的关键作用,为研究其组装机制提供了基础实验依据,并为深入探索其在细胞内存活及致病机制奠定了基础.