浮萍原生质体瞬时表达体系的建立及其应用研究

Establishment and Application of Transient Expression System of Protoplast in Duckweed

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摘要[目的]建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程.[方法]采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法.利用农杆菌介导外源基因进入浮萍愈伤组织,并制备原生质体观察瞬时表达情况,通过对农杆菌种类、菌浓度、乙酰丁香酮浓度及共培养时间等参数进行调整,筛选最佳的浸染条件.最后利用该瞬时表达体系进行亚细胞定位研究和启动子功能验证.[结果]原生质体制备的最佳条件为:以4℃过夜培养的浮萍悬浮培养愈伤组织为制备材料,用酶液(2％纤维素酶、0.5％离析酶、0.5％果胶酶、0.1 mol/LCaCl2、0.2 mol/L KCl、1％ BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25℃避光消化16 h(40r/min);农杆菌浸染最佳条件为:农杆菌GV301在菌浓度(OD600)为1、乙酰丁香酮浓度为100 μmol/L时,浸染悬浮培养愈伤有最大转化率.[结论]成功建立了浮萍原生质体瞬时表达体系,并证明其可用于亚细胞定位和启动子功能验证等方面的研究.