换一批
换一批利用CRISPR/Cas9系统构建人HPRT1基因定点突变细胞株
Generation of cell strains containing point mutations in HPRT1 by CRISPR/Cas9
摘要Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase1(HPRT1)基因突变会导致次黄嘌呤和鸟嘌呤代谢异常,严重的代谢障碍被称为Lesch-Nyhan综合征,表现为智力低下,行为上出现强迫性自我毁伤,并伴随痛风或肾结石等症状.HPRT1基因具有多种突变模式,近年来对其突变谱的研究表明该基因具有一些"突变热点".本研究选取了导致翻译提前终止的热点突变c.508C>T突变和c.151C>T突变,在HEK293T和HeLa细胞中,以单链寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides,ssODN)作为同源重组模板,利用CRISPR/Cas9技术构建了这两种突变的单克隆细胞株,发生定点突变的效率分别为16.3％和10％.进一步通过Western blot检测点突变的单克隆细胞的HPRT1蛋白表达水平,通过6-TG毒性实验检测点突变的单克隆细胞的次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性,结果表明纯合突变的单细胞克隆不能正常表达HPRT1蛋白,其次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性丧失;杂合突变的单细胞克隆的HPRT1蛋白表达量降低,仍具有部分次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性.HPRT1基因定点突变细胞模型的建立可为今后建立其他HPRT1基因突变的细胞系或动物模型提供借鉴,为研究Lesch-Nyhan致病机制提供基础.
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栏目名称
研究报告
DOI
10.16288/j.yczz.19-108
发布时间
2019-11-08
基金项目
国家转基因生物新品种培育重大专项
广东省重点领域研发计划项目
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