不同CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统的比较及优化研究

Comparison and optimization of different CRISPR/Cas9 donor-adapting systems for gene editing

二维码有效期 120s

摘要在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中.然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一.为提高 CRISPR/Cas9 系统介导的 HDR 效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9 蛋白融合表达,利用其与特异性 DNA 序列结合的特性,构建了多种 CRISPR/SpCas9 供体适配基因编辑系统.为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9 供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子 3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测.结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11 和 N57 等接头蛋白与 SpCas9 蛋白 C-端融合对其活性均无显著性影响;在 GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11 系统介导的敲入效率.总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9 供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴.