换一批少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达
Cloning and Heterologous Expression of a Novel Δ6-Desaturase Gene from Rhizopus arrhizus NK030037
摘要根据真菌Δ6-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR,获得一个593 bp的cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3'和5'序列,从而得到全长为1 482 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 377 bp、编码458个氨基酸的开放阅读框,所编码蛋白质的大小为52 kD.与报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的N-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ6-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体pYES2.0,构建重组表达载体pYRAD6,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达.通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达.所编码的酶具有Δ6-脂肪酸脱氢酶活性,能将外源性的底物亚油酸转化为γ-亚麻酸,γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的3.85%.
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