盐藻肌动蛋白基因启动子驱动的bar基因表达作为核转化筛选标记

The Actin Gene Promoter-driven bar as a Dominant Selectable Marker for Nuclear Transformation of Dunaliella salina

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摘要运用基因组步行方法克隆盐藻肌动蛋白基因5'上游调控序列,发现相对于ATG上游-573和-424 bp的位置上分别有75 bp长的两个重复序列.没有典型的TATA盒,但有两个TATA样结构、一个CCAAT结构和一个与GCTC(G/C)AAGGC一致的序列.以700 bp的盐藻肌动蛋白基因启动子区序列驱动bar基因的表达作为转化盐藻的筛选标记.转化的藻细胞暗光恢复24 h后,在含0.5 μg/mL除草剂的培养基中常规培养生长1周,然后将细胞平铺于含0.5 μg/mL除草剂的固体培养基上继续筛选培养.约20 d后从固体培养板上挑选出5个藻落并作了进一步培养和分析.结果显示,5个转化藻中携带bar嵌合基因的整合位点均位于核基因组内.Southern blotting分析表明,仅有一个转化藻整合单拷贝的bar基因,而另外4个转化藻株则包含多个拷贝bar基因片段,提示盐藻核基因转化主要是外源基因的随机整合,外源基因在转化盐藻中的整合拷贝数并不影响其除草剂抗性.RT-PCR方法证明了bar基因在转化藻中的转录.5个转化藻在含除草剂的液体培养基中维持生长了至少7个月,表明核基因转化的稳定性.