奥利亚罗非鱼DMRT1和DMRT4抗体制备及组织表达谱分析

Generation of Antibodies Against DMRT1 and DMRT4 of Oreochromis aurea and Analysis of Their Expression Profile in Oreochromis aurea Tissues

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摘要DMRT1和DMRT4是DMRT基因家族的成员,该家族成员与果蝇的性别决定基因和线虫性别决定基因一样,所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的保守基序,即DM结构域,并以锌指结构与特异DNA序列相结合,在性别决定和分化发育中起调控作用.采用RT-PCR方法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢中扩增克隆出DMRT1和DMRT4全长cDNA片段,构建表达载体,在大肠杆菌中表达了BMP-DMRT4和BMP-DMRT1蛋白.经Xa切割、Amylose-sepharose柱层析纯化后作为抗原免疫新西兰白兔制备了DMRT1和DMRT4多克隆抗体,并进行纯化.对纯化多抗进行Western blot分析,结果表明获得了高特异性的DMRT1和DMRT4抗体.为了观察DMRT1和DMRT4在组织中的表达谱,首先,我们通过实时荧光定量RT-PCR检测雌雄奥利亚罗非鱼多种组织mRNA的表达,仅在卵巢和脑中检测到DMRT4,在精巢中检测到DMRT1;其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Westernblot分析,仅分别在卵巢和精巢中检测到DMRT4和DMRT1蛋白的表达;制备多种奥利亚罗非鱼组织切片,使用纯化的DMRT4和DMRT1多抗进行免疫组织化学分析,发现DMRT4仅在卵巢表达,而DMRT1仅在精巢表达.这些结果有助于阐明DMRT4和DMRT1的功能及在鱼类性别调控中的作用.