家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征

Bombyx mori Pyridoxal Kinase cDNA Cloning and Enzymatic Characterization

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摘要吡哆醛激酶(EC 2.7.1.35)在ATP和Zn2+的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛(PLP).在生物体内许多酶促反应中,PLP是一种重要的辅酶因子.家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素B6前体来合成PLP.文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用PCR方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的cDNA(GenBank登录号:DQ452397).克隆到的cDNA含有一个894 bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1 kDa,含298个氨基酸残基的蛋白质.序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少10多个残基.多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基.采用T7启动子和T7聚合酶表达系统对克隆到的cDNA进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测.实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为10%,细胞粗提物具有活力为30 nmol/min/mg的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的cDNA编码家蚕中的吡哆醛激酶.