A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达

Construction of A546D mutant TGFBI plasmid and its expression in vitro

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摘要目的构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.

作者曹文萍 ^[1] 苑海刚 ^[2] 刘平 ^[1] 朱静 ^[3] 李雪 ^[1] 胡琦 ^[1] 学术成果认领

作者单位哈尔滨医科大学附属第一医院眼科, 黑龙江省哈尔滨市,150001 ^[1] 黑龙江省中医药大学附属第一医院普外科, 黑龙江省哈尔滨市,150040 ^[2] 哈尔滨医科大学遗传学教研室, 黑龙江省哈尔滨市,150001 ^[3]

关键词 TGFBI 重叠延伸PCR 人角膜上皮细胞转染 TGFBI SOE-PCR human corneal epithelial cell transfection

主题词突变(Mutation)基因(Genes)转染(Transfection)细胞(Cells)上皮, 角膜(Epithelium, Corneal)

栏目名称 实验研究

DOI 10.13389/j.cnki.rao.2015.0142

发布时间 2016-12-29

基金项目

黑龙江省博士后科研启动基金 黑龙江省卫生厅科研基金 哈医大一院科研基金(编号:2011BS017)Ph.D.Programs Foundation of Heilongjiang Province Research Foundation of Heilongjiang Health Department Research Foundation of the First Hospital Affiliated to Harbin Medical University