摘要目的 研究MYCN过表达诱导的视网膜肿瘤发展过程中的细胞特征,寻找在此过程中发挥重要作用的关键蛋白.方法 选择在体外培养1年和2年的T-MYCN细胞(分别为T-MYCN Y1细胞和T-MYCN Y2细胞),组成后续实验的T-MYCN Y1组和T-MY-CN Y2组细胞.WERI-Rb-1细胞系从中国科学院上海细胞库获得,作为成熟RB对照组(WERI-Rb-1组);未经处理的人正常视网膜组织作为对照组.将细胞按照每孔1 ×104个细胞接种于24孔板,在显微镜下观察细胞形态并采集图像;在接种后第4、8、12天进行细胞计数.使用免疫荧光染色检测各组细胞增殖标记物Ki67和视锥细胞标记物L/M opsin的表达;采用qRT-PCR检测各组细胞中MYCN、CCNB1、CDK1、SYK和RXRγ的表达情况;通过蛋白质组学分析各组细胞间蛋白表达谱差异并筛选关键调控基因;采用慢病毒敲低OTX2表达后检测各组细胞的生长增殖能力.结果 生长曲线显示,在体外培养第12天,T-MYCN Y1 组、T-MYCN Y2 组和 WERI-Rb-1 组细胞数量分别为(59.17±4.01)× 104 个、(85.14±4.54)× 104 个、(100.73±1.99)× 104 个(均为P＜0.05).与对照组相比,T-MYCN Y1组、T-MYCN Y2组和 WERI-Rb-1组Ki67和L/M opsin阳性细胞率均增加(均为P＜0.001).与对照组相比,T-MYCN Y1 组、T-MYCN Y2 组和 WERI-Rb-1 组细胞的 MYCN mRNA相对表达量均显著升高(均为P＜0.001),CCNB1和CDK1 mRNA相对表达量亦均升高(均为P＜0.01).与对照组相比,T-MYCN Y1组细胞的SYK mRNA相对表达量无明显变化(P＞0.05),RXRγ mRNA相对表达量显著升高(P＜0.05);T-MYCN Y2组和WERI-Rb-1组细胞的SYK、RXRγ mRNA相对表达量均显著升高(均为P＜0.05).GO富集分析显示这些差异蛋白富集到蛋白质复合体组装和线粒体等通路;KEGG富集分析显示这些差异蛋白富集到碳代谢、代谢途径和脂肪酸降解等通路.蛋白质组学和Western blot分析结果均显示,OTX2在 WERI-Rb-1组细胞中表达水平最高,其次为T-MYCN Y2组细胞,T-MYCN Y1组细胞最低.qRT-PCR结果显示,在T-MYCN Y1组、T-MYCN Y2组和WERI-Rb-1组细胞中,与空载对照组相比,OTX2敲低组的OTX2 mRNA相对表达量均下降(均为P＜0.05);细胞生长曲线显示,在三组细胞中敲低OTX2后,细胞的生长增殖能力均下降,差异均有统计学意义(均为P＜0.001).结论 MYCN过表达诱导的视网膜肿瘤发展过程中,细胞逐渐呈现出与WERI-Rb-1细胞类似的视网膜母细胞瘤特征;OTX2在MYCN扩增或高表达RB的生长增殖中发挥重要作用,靶向OTX2可能成为治疗RB新的研究方向.