平台化高通量pH梯度阳离子色谱法在单克隆抗体电荷异质性分析中的应用研究

The application of a high-throughput pH gradient cation-exchange chromatography method for charge variants separation of multiple monoclonal antibodies

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摘要目的:建立应用pH梯度分离的高通量、平台化高效液相阳离子交换色谱法,用于单克隆抗体电荷异质性分析.方法:利用不同pH的三羟甲基氨基甲烷、咪唑、哌嗪缓冲液组成pH梯度进行梯度洗脱,采用相同色谱柱、流动相和分离梯度对不同等电点的单抗进行分离.结果:用该法对美国药典收录的3种单抗一贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗进行检测,并与对应各论中记载的盐梯度方法比较,结果显示3种单抗主峰与酸区、碱区的分离度均有改善,贝伐珠单抗分离度分别提高了44％和500％;曲妥珠单抗分离度分别提高了83％和233％;利妥昔单抗酸区分离度由无法给出提高到0.7,碱区分离度提高了10％.针对贝伐珠单抗的方法进行再次优化(提高40％通量)并开展方法学验证.结果显示方法专属性良好,高温破坏后可观察到酸区和碱区杂质均有趋势性增加;精密度良好,重复性实验中主峰保留时间RSD为0.12％,中间精密度实验中酸区、主峰、碱区百分比峰面积RSD均小于2％;准确度良好,酸区、主峰、碱区在5个不同的浓度级别中回收率总体平均值分别为100.4％,101.0％,101.4％;线性良好,蛋白含量0.8～1.2 mg·mL-1范围内酸区、主峰、碱区峰面积均与样品浓度呈线性关系,主峰与碱区线性相关系数R2均大于0.999,酸区R2为0.988;耐用性良好,检测条件发生一定变化时,酸区、碱区和主峰的百分比峰面积测定RSD均小于3％.结论:建立的平台化pH梯度方法适用于不同单抗的电荷异质性分析,且具有良好的分离度,为单抗的研究和开发提供了一种通量更高的分离手段和分析方法.