换一批多重数字PCR在rAAV基因组完整性评价中的探索应用
Exploration and application of multiplex dPCR in rAAV genome integrity evaluation
摘要目的:探索采用多重数字PCR(dPCR)技术评价重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)基因组完整性的可行性.方法:采用芯片式dPCR系统,针对rAAV基因组的末端反向重复序列(ITR)区和目的基因(或3'非翻译区)建立双重PCR法,通过适量稀释使模板DNA在PCR芯片中呈理论单拷贝分布(阳性孔低于20％),单阳性孔代表非完整片段,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价rAAV基因组的完整性;尝试采用不同样品前处理方式(病毒基因组DNA、病毒颗粒、DNase Ⅰ处理),并比较测试结果.结果:双重PCR测得拷贝数与单重PCR基本一致,无明显干扰;在一定范围内,样本的实测拷贝数与模板量呈线性相关,但单阳、双阳比例基本一致;提取的病毒基因组DNA实测拷贝数减少,但双阳率高于未处理病毒样本,DNase Ⅰ处理后的病毒样本实测拷贝数明显减少,单阳、双阳比例与未处理病毒样本基本一致.结论:多重dPCR技术可用于评价rAAV产品基因组完整性,具有良好的应用前景.
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关键词
多重数字PCR重组腺相关病毒基因组完整性末端反向重复序列目的基因multiplex dPCRrecombinant adeno-associated virus(rAAV)genome integrityinverted terminal repeat(ITR)gene of interest
分类号
R917（药物分析）
栏目名称
DOI
10.16155/j.0254-1793.2023.12.01
发布时间
2024-03-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
北京市科技计划（Z221100007922015）
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