换一批Klenow(exo-)的表达、活性测定及其在焦磷酸测序中的应用
Expression, Activity Measurement of Exonuclease-Deficient Klenow Fragment and its Application in Pyrosequencing
摘要野生的Klenow聚合酶具有3′-5′外切酶活性,会对引物进行切割而造成焦磷酸测序产生错误的延伸信号.为了制备缺失3′外切酶活性的Klenow聚合酶用于焦磷酸测序反应,该研究全合成了外切酶活性缺失突变的Klenow酶基因编码序列,将其插入到表达载体pET28a(+)中构建重组质粒,并转化到大肠杆菌中,表达外切酶活性缺失的Klenow酶(Klenow(exo-)).通过优化诱导温度、诱导时间与诱导剂浓度,得到了Klenow(exo-)的最佳表达条件为30℃时诱导表达5h且IPTG浓度为0.1 mmol/L.利用Ni+柱亲和层析法纯化得到了相对分子质量约为67 000的重组Klenow(exo-)酶,并建立了基于生物发光的酶活测定方法,最终将其用于焦磷酸测序反应.结果表明,制备的重组酶具有良好的聚合酶活性但缺失了3′外切酶活性,可成功测定DNA待测模板序列,为焦磷酸测序技术提供了一个有效的关键酶.
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关键词
Klenow酶外切酶活性焦磷酸测序重组表达表达条件优化Ni+柱亲和层析法生物发光Klenow fragmentExonuclease activityPyrosequencingRecombinant expressionExpression condition optimizationNi+ affinity chromatographyBioluminescent
分类号
Q812（基因工程《遗传工程》）
栏目名称
发布时间
2016-08-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（No.31200638）
国家自然科学基金（21275161）
国家自然科学基金（21475151）
国家自然科学基金（31300704）
江苏省基础研究计划自然科学研究项目（No.BK20151445,No.BK20140656）
中国博士后科学基金（No.2012M512179）
中国博士后科学基金（2013T60962）
中国博士后科学基金（No.2015M572809）
中央高校基本科研业务费专项重点项目（No.2015ZD008）
药物质量与安全预警教育部重点实验室项目（No.DQCP2015MS02）
:江苏高校优势学科建设工程项目
:江苏省"青蓝工程"项目
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