小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

Construction and identification of a recombinant adenoviral vector expressing murine dendritic cell-associ-atedC-type lectin-1

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摘要目的：树突状细胞相关C型凝集素-1（ dendritic cell-associated C-type lectin-1， Dectin-1）是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体，扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段 CLEC7A-pIRES2-EGFP 重组到中间载体 pDONR221上，再与腺病毒骨架质粒 pAD／CMV／V5-DEST重组，获得重组腺病毒质粒pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP，经Pac I线性化后转染人胚肾293（ HEK293）细胞，收获重组腺病毒pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP；利用HEK293细胞大量扩增腺病毒；并进行重组腺病毒的滴度测定；用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组（ Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞）和转染空病毒组（空病毒转染HEK293细胞）中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因，腺病毒滴度为5×1011 IU／mL，荧光显微镜下可见绿色荧光，PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677．25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体，为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。