胱天蛋白酶募集域蛋白9-麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化

Prokaryotic expression and purification of recombinant CARD9-MBP fusion protein

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摘要目的胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)可激活核因子-κB(NF-κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等通路参与免疫,但其作用机制至今尚未阐明.为进行相关体外实验,构建CARD9-麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化.方法利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列,将两者正确插入pET-30a(+)载体中得到重组质粒,后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,并进行PCR和酶切鉴定以及基因测序.将正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选不同条件进行IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量.通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9-MBP融合蛋白进行纯化,用HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后进行MALDI-TOF质谱鉴定.结果成功构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致.SDS-PAGE电泳显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为105000的目的蛋白.通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化后,可得到相对较纯的融合目的蛋白,经HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后行MALDI-TOF质谱鉴定其确为CARD9蛋白.后期通过分子筛层析柱进一步纯化得到了更纯的CARD9-MBP融合蛋白.结论成功构建了重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,并进行了大量可溶性表达.通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱的纯化,可得到较纯的目的蛋白.