换一批
换一批摘要目的 构建再生基因蛋白3β(regenerating islet-derived protein 3 beta,Reg3β)干扰载体,并在H9C2大鼠心肌细胞中优化转染条件,鉴定抑制效果,为深入探索Reg3β在心血管疾病的作用提供有利的工具.方法 设计合成Reg3β干扰序列,在5'端加入一个SacⅠ的酶切位点,3'端加入LOOP环序列和反向互补序列,构建pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体.接着分别用Li-pofectamine2000和Lipofectamine3000优化摸索转染大鼠H9C2心肌细胞的效率,以q-PCR和Western blot法检测H9C2细胞内Reg3β的表达量.结果 设计合成了3对Reg3β干扰序列,从中筛选出抑制效率最高达67.93％的序列,酶切和测序结果 证实成功构建了pG1.2-Reg3βshRNA.经过优化比较发现,pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体Lipofectamine3000比例为1μg:3μl时,其转染效率最高(50％以上).q-PCR和Western blot法检测结果 显示,最佳干扰载体在最高转染条件下可使H9C2细胞Reg3β表达量降低50％以上.结论 成功构建了pG1.2-Reg3βshRNA沉默载体,并在H9C2细胞中有效干扰Reg3β的表达,可用于探讨Reg3β在心血管疾病中的作用.
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