双抗体夹心酶联免疫吸附试验在肺炎支原体抗原检测中的建立与应用

Establishment and application of a double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay method for the detection of Mycoplasma pneumoniae antigens

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摘要目的构建用于检测肺炎支原体抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法,并应用其检测不同耐药表型临床分离株抗原.方法鉴定抗肺炎支原体单克隆抗体4G4、8H6的抗体结合位点竞争性及结合活性;以4G4为包被抗体,8H6为酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法,优化其线性范围、稳定性、特异性、广泛适用性与准确度.结果单克隆抗体4G4、8H6具有不同的抗原结合位点,半数最大效应浓度(EC50)分别为0.411 3、0.188 1 μg/ml;最佳反应体系为包被抗体浓度4 μg/ml,酶标抗体1∶4 000稀释,封闭液为含2％BSA、2％蔗糖的0.01 mol/L PBS.该方法线性范围为1～32 U,线性回归方程Y=0.074 2X+0.073,R2=0.996 9;批间变异系数为0.478 4％～7.961 3％,批内变异系数为1.615 8％～13.175 4％;特异性与广泛适用性佳,不与新型冠状病毒感染、流感、猴痘病毒及多种细菌交叉反应,可检测不同耐药株抗原;与肺炎支原体抗原检测商用试剂盒(ELISA法与胶体金法)检测结果符合率96.7％～103.3％.结论该双抗体夹心ELISA法线性范围优、稳定性强、特异性好、适用广、准确度高,可用于肺炎支原体疫苗生产中的抗原定量.